Pfaffstätten liegt an der Thermenlinie - der westlichen Abbruchkante des Wiener Beckens. Hier treffen die Alpen mit ihren östlichen Ausläufern - dem Wienerwald - und die pannonische Tiefebene zusammen. Tiere und Pflanzen beider Regionen kommen hier gemeinsam mit weiteren besonderen Arten aus dem Mittelmeerraum vor. Das ist der Grund für eine herausragende Artenvielfalt in der Region, die die Thermenlinie zu einem Hot spot der Artenvielfalt in ganz Mitteleuropa macht.

Pfaffstätten ist - ohne Übertreibung - eine der ökologisch besonders hervorragend ausgestatteten Gemeinden der Thermenlinie. Das liegt an den vielen verschiedenen Lebensräumen: Wälder, Trockenrasen, Wiesen, reich strukturierte Weingärten und kleine Höhlen an den Abhängen des Wienerwaldes, Siedlungsgebiet, Weingartenlandschaft, Äcker, Feuchtwiesenreste und Gewässer wie Wiener Neustädter Kanal und Badener Mühlbach in der Ebene.

Auf Grund der einzigartigen Vielfalt gehört Pfaffstätten zum europäischen Schutzgebietsnetzwerk NATURA 2000, ist Teil des Biosphärenparks Wienerwald und großteils Landschaftsschutzgebiet. Mit dem Naturschutzgebiet Glaslauterriegel-Heferlberg-Fluxberg, dem Naturdenkmal Iriswiese und den geschützten Höhlen Einödhöhle und Elfenhöhle gibt es in Pfaffstätten eine Reihe besonders hochwertiger Naturjuwele.

Beim Tag der Artenvielfalt 2009 des Biosphärenpark Wienerwald entdeckten 78 Expertinnen und Experten viele seltene und geschützte Arten. Die Ergebnisse wurden im Büchlein Natur in Pfaffstätten veröffentlicht.